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淺談PCR反應體係構建設計中的重要要素--引物

點擊次數:13次  發布時間:2020-11-11
  PCR具有突出的優勢,如特異性,靈敏度,高產率,快速,簡便,可重複性好,易於自動化。它可以在試管中分析待研究的靶基因,或者可以在幾個小時內將某個基因片段擴增到十萬甚至一百萬次,使肉眼可以直接觀察判斷。從頭發,一滴血甚至是細胞中提取的DNA都可以擴增出足夠數量的DNA用於分析研究和測試鑒定。PCR技術是生物醫學領域的一項革命性舉措和裏程碑。因此,PCR反應體係構建是非常必要的。
  PCR反應的五個要素:參與PCR反應的五種主要物質,即引物,酶,dNTP,模板和Mg2+。引物是在PCR反應體係構建特定反應的關鍵。PCR產物的特異性取決於引物和模板DNA之間的互補程度。從理論上講,隻要您知道任何模板DNA序列,就可以設計一條互補的寡核苷酸鏈作為引物,並使用PCR在體外大量擴增模板DNA。
 

PCR反應體係構建

  PCR反應體係構建設計中引物應遵循什麽原則?
  1、引物長度:15-30bp,通常在20bp左右;
  2、引物擴增範圍:200-500bp為宜,具體條件可擴增最大10kb的片段;
  3、引物堿基:40%-60%的G+C含量合適,G+C太少,擴增效果差,G+C太容易出現非特異性條帶。ATGC是隨機分布的,避免了5種以上的電子核苷酸嘯叫或字符串排列;
  4、避免引物的二級結構,避免兩個引物之間的互補,尤其是3'末端互補,否則會形成引物二聚體以產生非特異性擴增條帶;
  5、引物3'末端的堿基,尤其是最後一個和倒數第二個堿基,應嚴格配對,以避免末端堿基的堿基錯配導致PCR失敗。
  6、引物具有或可以加入合適的限製位點。擴增的靶序列應具有合適的限製位點。這適合進行限製性分析或分子克隆非常有益;
  7、引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫中的其他序列沒有明顯的同源性。
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