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PCR反應體係構建中引物的設計原則

點擊次數:6  發布時間:2020-11-16
   引物是PCR反應體係構建的關鍵,PCR產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上任何一段模板DWA序列,就能按其設計互補的寡桉苷酸鏈做引物,利用PR就可將模板DWA在體外大量擴增。

PCR反應體係構建

  PCR反應體係構建中引物的設計原則:
  1、引物長度:15-30bp ,常用為20bp左右;
  2、引物擴增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段;
  3、避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,不然會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帯;
  4、引物堿基:G+C含量以40-60M為宜,G+C 太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGc一般隨機分布,避免5個以上的嘌呤或吒啶核苷酸的成串排列;
  5、引物3端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗;
  6、引物中有或能加上合適的酶切位點,被擴增的靶序列一般有適宜的酶切位點,這對酶切分析或分子克隆很友好;
  7、引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量以每條引物0.1-1umol或10-100pmo1,以較低引物量產生所需要的結果為準,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。
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