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建立PCR反應體係時需注意的幾個問題

點擊次數:13  發布時間:2020-11-09
   PCR鏈式反應,也稱聚合酶鏈式反應,是一種體外酶促合成特定DNA片段的方法。它由幾個反應組成,如高溫變性、低溫退火和在合適溫度下延伸,這些反應在循環,進行,以便能夠快速擴增目標DNA。它具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、省時的特點。
  建立PCR反應體係時需注意的幾個問題
  首先要說的是Taq酶,其特征是5`→3`DNA聚合酶活性,缺乏5`→3`核酸外切酶活性,在70-75攝氏度時活性較高。在典型的聚合酶鏈反應中,當總反應體積為100微升時,需要約2.5微升Taq酶。需要注意的是,使用的酶量太高,不會引起非特異性擴增,而當酶量太低時,合成產物的量會減少。
  第二要注意的是dNTP的質量和濃度。脫氧核糖核酸的質量和濃度與聚合酶鏈反應擴增效率密切相關。在PCR反應中,dNTP一般應為50 ~ 200 umol/L,濃度過低會降低PCR產物的產量,dNTP可以與Mg2結合降低遊離Mg2的濃度。四種dNTP的濃度應該相等(如摩爾製劑),如果其中任何一種不同於其他種類(高或低),就會造成不匹配;dNTP保存不當,使其不穩定,不活躍。少量包裝,在-20攝氏度冷凍。反複凍融會降解dNTPdNTP溶液呈酸性,應配製成高濃度,然後用1M  NaOH或1M  Tris-HCl緩衝液調節pH值至7.0 ~ 7.5。
  第三、模板的數量。在一般的聚合酶鏈反應擴增中,104到107個模板分子可以獲得滿意的結果。
  第四、Mg2濃度,一般PCR反應中,當各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2
  濃度一般為1.5 ~ 2.0 mmol/L,Mg2濃度過高,反應特異性降低,出現非特異性擴增。濃度過低,Taq  DNA聚合酶活性降低,反應產物減少。
  最後,引物是聚合酶鏈反應特異性反應的關鍵,聚合酶鏈反應產物的特異性取決於導入
  DNA與模板的互補程度。為了保持尹武,的完整性,應避免反複凍融。
  當然要特別注意加入的水,一個是ph,一個是純度。
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